PCR反應(yīng)引物設(shè)計基礎(chǔ):（99%的問題可以解決）

1.引物長度：教科書要求15-30bp，常用為20bp左右。實(shí)際情況zui好是18-24bp，以保證特異性，不是越長越好，太長的引物同樣會降低特異性，并且降低產(chǎn)量 。

2.引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGCzui好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性，避免3'端GC rich， zui后3個堿基不要有GC，或者zui后5個有3個不要是GC。

4.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

5.引物3’端的堿基，特別是zui末及倒數(shù)第2個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

6.引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列zui好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

7.引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

8.學(xué)會使用軟件：PP5，Oligo6，DNAstar，Vector NTI，primer3（這個在線設(shè)計zui好用）。

以上內(nèi)容，至少可以解決99%的引物設(shè)計問題。