實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴(kuò)增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針，當(dāng)與擴(kuò)增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時會發(fā)出信號，從而可以對目標(biāo)序列進(jìn)行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達(dá)分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用。

RT-qPCR原理的三個主要步驟：

1、反轉(zhuǎn)錄：

1.1、使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2、該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。

1.3、反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。

2、PCR擴(kuò)增：

2.1、使用特定引物對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這些引物環(huán)繞目標(biāo)區(qū)域。

2.2、PCR是一個循環(huán)過程，呈指數(shù)級擴(kuò)增DNA模板的數(shù)量。

2.3、PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針，它們結(jié)合到擴(kuò)增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號。

3、熒光實時檢測：

3.1、使用實時PCR儀器實時監(jiān)測熒光信號。

3.2、熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴(kuò)增的DNA數(shù)量成比例。

3.3、使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達(dá)到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標(biāo)DNA量，從而允許進(jìn)行基因表達(dá)或病毒載量等定量分析。