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提高PCR特異性熱啟動(dòng)方法闡述
日期：2025-04-24 16:57
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摘要： 熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開(kāi)始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，...
熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開(kāi)始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
熱啟動(dòng)通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動(dòng)方法十分煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開(kāi)。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。
Platinum DNA聚合酶對(duì)于自動(dòng)熱啟動(dòng)PCR來(lái)說(shuō)方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分為復(fù)合有抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體的重組Taq DNA聚合酶。抗體在PCR配制，以至于在室溫的延時(shí)保溫過(guò)程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在變性步驟的94℃保溫過(guò)程中被釋放到反應(yīng)中，恢復(fù)了完全的聚合酶活性。同經(jīng)化學(xué)修飾用于熱啟動(dòng)的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延時(shí)保溫（10到15分鐘）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃進(jìn)行2分鐘就可以恢復(fù)90％的Taq DNA聚合酶活性。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
熱啟動(dòng)通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動(dòng)方法十分煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開(kāi)。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。
Platinum DNA聚合酶對(duì)于自動(dòng)熱啟動(dòng)PCR來(lái)說(shuō)方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分為復(fù)合有抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體的重組Taq DNA聚合酶。抗體在PCR配制，以至于在室溫的延時(shí)保溫過(guò)程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在變性步驟的94℃保溫過(guò)程中被釋放到反應(yīng)中，恢復(fù)了完全的聚合酶活性。同經(jīng)化學(xué)修飾用于熱啟動(dòng)的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延時(shí)保溫（10到15分鐘）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃進(jìn)行2分鐘就可以恢復(fù)90％的Taq DNA聚合酶活性。